بررسی اثر آنزیم آلژینات لیاز بر روی بیوفیلم pseudomonas aeruginosa بیمارستانی و تعیین خصوصیات ژن آنزیم

pseudomonas aeruginosa یک باکتری گرم منفی، هوازی، میله ای شکل است که دارای دو فنوتیپ موکوئیدی و غیر موکوئیدی است. سویه های موکوئیدی پلیمر آلژینات تولید می کنند که عامل اصلی مزمن شدن عفونت های حاصل از p.aeruginosa می باشد که با تشکیل بیوفیلم، مقاومت بالایی در برابر آنتی بیوتیک ها از خود نشان می دهند. آنزیم آلژینات لیاز توانایی تولید و تجزیه ی آلژینات را دارا می باشد بنابراین تجزیه ی زیستی بیوفیلم های p.aeruginosa موکوئیدی با استفاده از آلژینات لیاز مورد توجه محققان می باشد. آلژینات لیاز می تواند با کاهش چسبندگی موجب کنده شدن بیوفیلم از سطوح شده و فاگوسیتوز باکتری را توسط سلول های ایمنی بدن افزایش داده و اثر آنتی بیوتیک های ضد سودوموناس را تشدید کند. در این پژوهش هدف استخراج و بررسی برخی ویژگی های آنزیم آلژینات لیاز p.aeruginosa بیمارستانی و تخلیص آن و بررسی اثر آن بر بیوفیلم p.aeruginosa می باشد. در این پژوهش آلژینات لیاز دو سویه ی 48 p.aeruginosa (که از خلط بیمار تنفسی جدا شد) و pao1 p.aeruginosa با روش شوک حرارتی استخراج شد و پایداری گرمایی آن ها، تاثیرگذاری بر بلوک های آلژینات و اثر سدیم کلرید بر فعالیت آن ها مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که این آنزیم ها مقاومت گرمایی بالایی در دمای 80 درجه سانتیگراد دارند، به طوری که بعد از 4 ساعت هم مقداری از فعالیت خود را حفظ می کنند. هر دوی این آنزیم ها بر هر دو بلوک m و g از آلژینات تاثیر دارند و آنزیم های هر دو سویه در حضور کلرید سدیم با غلظت بالا، بالاترین فعالیت را از خود نشان می دهد. در ادامه پژوهش، تخلیص آنزیم با دو روش کروماتوگرافی ستونی تعویض یونی deae–sepharose cl-6b و ستون کروماتوگرافی تمایلی epoxy activated sepharose 6-b انجام شد. نتیجه آن روی ژل پلی آکریل آمید 12% حاوی sds مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت و پروتئینی با وزن مولکولی در حدود 60 کیلودالتون مشاهده شد. هم چنین اثر آنزیم روی بیوفیلم pao1 p.aeruginosa و 48 p.aeruginosa به روش پلیت میکروتیتر و میکروسکوپ الکترونی نگاره بررسی شد. نتایج نشان داد که آنزیم سویه 48 روی بیوفیلم خود و بیوفیلم سویه pao1 اثر تخریبی داشت. در نهایت ویژگی سوبسترایی آنزیم در سطح dna با روش pcr مورد بررسی قرار گرفت و ناحیه حفاظت شده برای polym لیازها در سویه 48 تایید شد.